醫(yī)用高氮無(wú)鎳奧氏體不銹鋼的制備與生物相容性研究

 浙江至德鋼業(yè)有限公司通過(guò)對(duì)不同含氮量的無(wú)鎳奧氏體不銹鋼材料對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及血小板粘附的影響。通過(guò)溶血率和血小板粘附試驗(yàn)考察不同含氮量的無(wú)鎳奧氏體不銹鋼材料的血液相容性；通過(guò)MTT試驗(yàn)和細(xì)胞粘附試驗(yàn)考察不同含氮量的無(wú)鎳奧氏體不銹鋼材料的細(xì)胞相容性。結(jié)果表明不同含氮量的無(wú)鎳奧氏體不銹鋼材料的溶血率都低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的5%，對(duì)血小板粘附的影響不顯著；粘附在高氮無(wú)鎳奧氏體不銹鋼材料表面的血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量均多于鈦合金材料，且細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好；細(xì)胞毒性試驗(yàn)表明，不同含氮量的高氮無(wú)鎳奧氏體不銹鋼材料和對(duì)照組鈦合金材料對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞沒(méi)有產(chǎn)生明顯的毒副作用。

  在心血管疾病中，冠心病對(duì)人類生命健康的威脅最大，是造成人類死亡最主要的原因。冠心病的治療可分為藥物治療、外科手術(shù)治療和介入治療3大類。冠心病介入治療以其手術(shù)創(chuàng)傷小、患者痛苦少，在急性冠脈綜合征等緊急情況下也可迅速實(shí)現(xiàn)血運(yùn)重建，從而成為冠心病治療的重要手段。目前在接受介入治療的患者中，約95%以上的病變需要植入支架，支架植入術(shù)已成為介入治療的核心技術(shù)。常用的金屬支架主要有316L不銹鋼支架、鈦鎳合金支架、鉭支架等。316L不銹鋼、鈦鎳合金支架材料在使用過(guò)程中會(huì)釋放出鎳離子，鎳被認(rèn)為是毒性元素，它能夠?qū)е逻^(guò)敏反應(yīng)和癌癥；在血液中316L不銹鋼、鈦鎳合金支架材料的使用容易形成血栓，從而影響支架的血液相容性。

 目前不銹鋼材料存在2個(gè)問(wèn)題，即不銹鋼材料處在生理環(huán)境下，會(huì)析出鎳離子；材料自身性質(zhì)的退變會(huì)導(dǎo)致其失效。近年來(lái)，有學(xué)者研究了高氮無(wú)鎳奧氏體不銹鋼材料在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用，與傳統(tǒng)的316L不銹鋼相比，這種不銹鋼不僅保證了無(wú)有害物質(zhì)鎳離子析出，而且在提高強(qiáng)度的同時(shí)保持了高的韌性和塑性。

 本文主要采用真空感應(yīng)熔煉和電渣重熔雙聯(lián)冶煉工藝，經(jīng)鍛造軋制制備出含氮量分別為0.50%、0.56%以及0.62%的 17Cr15Mn2MoN無(wú)鎳奧氏體不銹鋼；鈦合金作為參照，采用溶血率以及血小板粘附試驗(yàn)對(duì)高氮無(wú)鎳奧氏體不銹鋼的血液相容性進(jìn)行考察；通過(guò)細(xì)胞毒性以及細(xì)胞粘附試驗(yàn)對(duì)其細(xì)胞相容性進(jìn)行考察。

一、醫(yī)用高氮無(wú)鎳奧氏體不銹鋼的制備與表征

 試驗(yàn)采用真空感應(yīng)熔煉和電渣重熔雙聯(lián)冶煉工藝，經(jīng)鍛造軋制制備出含氮量分別為0.50%、0.56%以及0.62%的高氮無(wú)鎳奧氏體不銹鋼，將制備出的材料切割成直徑為15mm、厚度為2mm的圓片，對(duì)其進(jìn)行沖擊性能、拉伸性能和顯微組織觀察。

 1. 醫(yī)用高氮無(wú)鎳奧氏體不銹鋼的血液相容性研究

 a. 血小板粘附試驗(yàn)

  按照血液與抗凝劑9:1的比例，將3.8%的枸櫞酸鈉抗凝劑加入到新鮮兔血中，轉(zhuǎn)速為1200 r/分鐘，離心10分鐘，收集富血小板血漿。樣品經(jīng)生理鹽水浸泡、洗滌后，放入PRP中，在37℃的培養(yǎng)箱中放置60分鐘。用PBS輕輕沖洗樣品，然后放入2.5%的戊二醛溶液中，4℃下固定30分鐘。室溫下，用乙醇進(jìn)行梯度脫水處理，時(shí)間間隔15分鐘。樣品冷凍干燥24小時(shí)，噴金后用掃描電子顯微鏡觀察。

  b. 溶血率試驗(yàn)

  將樣品用無(wú)水乙醇、超純水超聲清洗各10分鐘。在試管中加10mL的生理鹽水，并在37℃下預(yù)熱30分鐘。樣品及0.2mL的稀釋血液放入試管中，在37℃培養(yǎng)箱中放置60分鐘。生理鹽水作陰性對(duì)照，蒸餾水作陽(yáng)性對(duì)照。然后所有試管以3000r/分鐘，離心5分鐘，取上清液，以蒸餾水為參比，在波長(zhǎng)545nm處測(cè)定上清液的吸光度值。

 2. 醫(yī)用高氮無(wú)鎳奧氏體不銹鋼的細(xì)胞相容性研究

  a. 細(xì)胞培養(yǎng)

  人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)在含10％血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，于37℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

  b. 細(xì)胞粘附形態(tài)學(xué)觀察

  取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，胰酶消化成單細(xì)胞懸液并調(diào)整細(xì)胞濃度至孔接種到放有材料的24孔培養(yǎng)板中，置37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每組設(shè)復(fù)孔3個(gè)，培養(yǎng)24小時(shí)。用PBS輕輕沖洗樣品，然后放入2.5％的戊二醛溶液中，4℃下固定30分鐘。室溫下，用乙醇進(jìn)行梯度脫水處理，時(shí)間間隔15分鐘。經(jīng)冷凍干燥24小時(shí)，噴金后用SEM觀察。

  c. 細(xì)胞增殖研究

  細(xì)胞接種與材料處理同方法培養(yǎng)至第1、3、5天時(shí)各隨機(jī)取出一塊24孔板，陽(yáng)性對(duì)照組即隨機(jī)取一組進(jìn)行檢測(cè)。每孔加入5mg/mL MTT溶液100μＬ，培養(yǎng)箱中放置4小時(shí)后取出，吸除孔內(nèi)液體，加DMSO溶液500μＬ，放入培養(yǎng)箱10分鐘后，取出微振蕩10分鐘使結(jié)晶充分溶解，于免疫酶標(biāo)儀上以490nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值，取3孔的平均值，用公式計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率，并對(duì)細(xì)胞毒性的結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。各試樣的細(xì)胞相對(duì)增殖率按下面公式進(jìn)行計(jì)算：RGR（%）＝試驗(yàn)組平均吸光度值陰性對(duì)照組平均吸光度值× 100%然后根據(jù)國(guó)家安全性標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的毒性標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各組結(jié)果進(jìn)行分級(jí)。

二、結(jié)果與討論

 1. 高氮無(wú)鎳奧氏體不銹鋼的組織結(jié)構(gòu)觀察及力學(xué)性能測(cè)試

  圖是試驗(yàn)鋼固溶處理后的顯微組織照片，可以看出，材料為單一奧氏體相，成分相近的普通奧氏體不銹鋼在固溶處理狀態(tài)下的物理性能幾乎相同，沒(méi)有太大區(qū)別，經(jīng)計(jì)算其晶粒度為8～9級(jí)。材料的抗拉強(qiáng)度是金屬材料由均勻塑性變形向局部集中塑性變形過(guò)渡的臨界值，表征金屬材料發(fā)生最大均勻塑性變形的抗力；屈服強(qiáng)度是指金屬材料抵抗微量塑性變形的應(yīng)力。由表可知本文所制備的高氮無(wú)鎳奧氏體不銹鋼的抗拉強(qiáng)度和屈服強(qiáng)度是普通316L不銹鋼的1倍以上。而延伸率與斷面收縮率等塑性指標(biāo)與普通的316L不銹鋼相當(dāng)。

  因此，高氮無(wú)鎳奧氏體不銹鋼不僅可以滿足316L不銹鋼基本的力學(xué)性能，而且能保證單一的奧氏體組織并且無(wú)有害元素鎳存在。

  2. 血小板在不同含氮量的不銹鋼材料表面的粘附結(jié)果

  血小板粘附、變形、聚集及釋放反應(yīng)是血栓形成的基礎(chǔ)，如果在相同接觸時(shí)間內(nèi)，材料表面粘附血小板數(shù)量少且不發(fā)生變形、聚集及釋放反應(yīng)，則說(shuō)明材料本身具有較好的血液相容性。

  圖為高氮無(wú)鎳奧氏體不銹鋼合金表面血小板粘附的SEM照片，由圖可見(jiàn)，在所有材料表面都有一定數(shù)量的血小板粘附，血小板圓整，分散比較均勻，除極個(gè)別的血小板有偽足形成外，沒(méi)有明顯的聚集和變形現(xiàn)象。在3000倍下隨機(jī)選取5個(gè)視野的SEM照片，對(duì)粘附的血小板數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，含氮量為0.50%和0.62%的無(wú)鎳奧氏體不銹鋼合金表面粘附的血小板數(shù)量與鈦合金表面粘附的血小板數(shù)量相比具有顯著性差異（5＜0.05），含氮量為0.56%的無(wú)鎳奧氏體不銹鋼合金表面粘附的血小板數(shù)量與鈦合金表面粘附的血小板數(shù)量相比具有極顯著性差異（p＜0.01）；而不同含氮量的不銹鋼合金表面粘附的血小板數(shù)量沒(méi)有顯著性差異（p＞0.05），表明含氮量對(duì)血小板的粘附影響并不顯著。

  3. 不同含氮量的不銹鋼材料的溶血率試驗(yàn)結(jié)果

  血液相容性是衡量生物材料尤其是心血管植入物等生物相容性好壞的一個(gè)重要評(píng)價(jià)指標(biāo)。紅細(xì)胞可因免疫反應(yīng)、化學(xué)、物理及其它多種因素的作用而發(fā)生溶血。溶血率是指當(dāng)生物材料與血液相接觸時(shí)，血液中的紅細(xì)胞將不同程度地遭到破壞，釋放出血紅蛋白，發(fā)生溶血現(xiàn)象，紅細(xì)胞的破壞程度代表了溶血率的大小。國(guó)家生物安全性評(píng)價(jià)溶血試驗(yàn)參考標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，若材料的溶血率＜5%，則說(shuō)明材料符合醫(yī)用材料的溶血試驗(yàn)要求，若溶血率＞5%，則預(yù)示試驗(yàn)材料有溶血作用。本文采用體外直接接觸法測(cè)定不同含氮量的無(wú)鎳奧氏體不銹鋼合金材料的血液相容性。結(jié)果證明高氮無(wú)鎳奧氏體不銹鋼合金材料和鈦合金材料的溶血率均＜5%，滿足醫(yī)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定的植入物溶血率的要求。

  4. 不同含氮量的不銹鋼材料表面細(xì)胞形貌觀察

  細(xì)胞在生物材料表面最初的行為表現(xiàn)是評(píng)價(jià)這種生物材料生物相容性的一個(gè)關(guān)鍵因素。當(dāng)細(xì)胞與生物材料接觸時(shí)，細(xì)胞的粘附、鋪展和遷移等一系列行為對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)都至關(guān)重要。圖是細(xì)胞在材料表面粘附1天后隨機(jī)進(jìn)行SEM觀察結(jié)果，由圖可以看出不同含氮量的無(wú)鎳奧氏體不銹鋼材料以及鈦合金材料表面所粘附的單個(gè)形態(tài)大體相同，細(xì)胞在材料表面呈梭形或不規(guī)則的三角形，細(xì)胞充分伸展，相互之間無(wú)顯著性差異。在1000倍下隨機(jī)選取5個(gè)視野的SEM照片，對(duì)粘附的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。高氮無(wú)鎳奧氏體不銹鋼合金表面粘附的細(xì)胞數(shù)量與鈦合金表面粘附的細(xì)胞數(shù)量相比具有顯著性差異（P＜0.05），不同含氮量的不銹鋼合金表面粘附的細(xì)胞數(shù)量沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05），表明含氮量對(duì)細(xì)胞的粘附影響并不顯著。

  5. 不同含氮量的不銹鋼材料的細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果

  MTT法又叫四甲基偶氮唑藍(lán)比色法，是目前最常用的一種評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性的方法。其主要原理是活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶和MTT相互作用生成難溶性藍(lán)紫色沉淀物甲瓚并沉淀于細(xì)胞中，結(jié)晶物的量與活細(xì)胞的數(shù)量及其活性有關(guān)，但死細(xì)胞不會(huì)發(fā)生這種反應(yīng)。沉積在細(xì)胞中的藍(lán)紫色沉淀物甲瓚可溶解于二甲基亞砜，在波長(zhǎng)490nm下，通過(guò)酶聯(lián)反應(yīng)法測(cè)其吸光度值，可間接地反應(yīng)活細(xì)胞的數(shù)量。從表可看出高氮無(wú)鎳奧氏體不銹鋼和鈦合金材料的細(xì)胞毒性級(jí)別在培養(yǎng)1、3、5天后都在0和1之間，說(shuō)明常溫狀態(tài)下高氮無(wú)鎳奧氏體不銹鋼和鈦合金材料性能穩(wěn)定，沒(méi)有毒性物質(zhì)析出，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的毒副作用。

三、結(jié)論

  1. 金相顯微組織證明，至德鋼業(yè)制備出來(lái)的高氮無(wú)鎳奧氏體不銹鋼由單一奧氏體組織組成，力學(xué)性測(cè)試結(jié)果證明，高氮無(wú)鎳奧氏體不銹鋼的抗拉強(qiáng)度和屈服強(qiáng)度等明顯高于普通316L不銹鋼材料。

  2. 溶血率試驗(yàn)和血小板粘附試驗(yàn)結(jié)果表明，不同含氮量的無(wú)鎳奧氏體不銹鋼材料的溶血率都低于5％，滿足國(guó)家對(duì)生物材料溶血率安全性規(guī)定的要求；粘附在材料表面的血小板數(shù)量較少，沒(méi)有明顯的聚集現(xiàn)象發(fā)生。說(shuō)明本文所驗(yàn)證的高氮無(wú)鎳奧氏體不銹鋼材料具有良好的血液相容性。

  3. 細(xì)胞相容性試驗(yàn)表明，不同含氮量的無(wú)鎳奧氏體不銹鋼材料對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、形態(tài)和增殖不構(gòu)成傷害，細(xì)胞毒性級(jí)別滿足國(guó)家安全性規(guī)定的要求。